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　　熒光探針是在紫外-可見-近紅外區有特征熒光，并且其 熒光性質可隨所處環境的性質，如極性、折射率、粘度等改變而靈敏地改變的一類熒光性分子。
 

　　常用于熒光免疫法中標記抗原或抗體，亦可用于微環境，如表面活性劑膠束、雙分子膜、蛋白質活性位點等處微觀特性的探測。通常要求探針的摩爾吸光系數大，熒光量子產率高；熒光發射波長處于長波且有較大的斯托克斯位移；用于免疫分析時，與抗原或抗體的結合不應影響它們的活性。
 

　　熒光探針的化學性質：熒光定量PCR所使用的熒光化學制劑可分為兩種：熒光探針和熒光染料。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成*同步。
 

　　實時熒光PCR技術靶基因的確定及引物和探針的設計原則
 

　　1.靶基因的確定：選擇檢測組共有的基因以避免檢測的假陰性。
 

　　2.檢測片段的確定：選擇檢測組內的保守 、組間特異的序列作為引物探針的設計位置。片段長度70-150bp。
 

　　3.引物：長度17-25bp;GC含量30-80%；退火溫度(Tm值)58-60℃；避免穩定的引物二聚體及發夾結構；序列不能出現連續的G，3’端避免G或C，后5個堿基內避免兩個以上的G或C。
 

　　4.熒光探針：長度20-30bp(Taqman)或16-25bp(MGB)；GC含量30-80%；Tm值為68-70℃；避免穩定的二聚體及發夾結構；5’端不能是G；位置盡量靠近上游引物；選擇波長差異較大或Fam的熒光標記。