熒光探針可隨所處環(huán)境的性質(zhì)，如極性、折射率、粘度等改變而靈敏地改變的一類熒光性分子。
熒光探針的作用用途：
常用于熒光免疫法中標(biāo)記抗原或抗體，亦可用于微環(huán)境，如表面活性劑膠束、雙分子膜、蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)等處微觀特性的探測。通常要求探針的摩爾吸光系數(shù)大，熒光量子產(chǎn)率高；熒光發(fā)射波長處于長波且有較大的斯托克斯位移；用于免疫分析時(shí)，與抗原或抗體的結(jié)合不應(yīng)影響它們的活性。
也可用于標(biāo)記待定的核苷酸片斷，用與特異性地、定量地檢測核酸的量。
熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)制劑可分為兩種：熒光探針和熒光染料。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。
實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)靶基因的確定及引物和探針的設(shè)計(jì)原則
1、靶基因的確定：選擇檢測組共有的基因以避免檢測的假陰性。
2、檢測片段的確定：選擇檢測組內(nèi)的保守(突變少)（避免假陰性）、組間特異的序列(突變多)（避免假陽性）作為引物探針的設(shè)計(jì)位置。片段長度70-150bp。
3、引物：長度17-25bp;GC含量30-80%；退火溫度(Tm值)58-60℃；避免穩(wěn)定的引物二聚體（特別是多聯(lián)檢測）及發(fā)夾結(jié)構(gòu)(自由能大于-3.5kc/m)；序列不能出現(xiàn)連續(xù)的G，3’端避免G或C，后5個(gè)堿基內(nèi)避免兩個(gè)以上的G或C。
4、探針：長度20-30bp（Taqman)或16-25bp(MGB)；GC含量30-80%；Tm值為68-70℃；避免穩(wěn)定的二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)(自由能大于-3.5kc/m)；5’端不能是G；位置盡量靠近上游引物；選擇波長差異較大（多聯(lián)檢測）或Fam(單聯(lián)檢測）的熒光標(biāo)記。
員_a.png)